jueves, 11 de diciembre de 2014

Bacterias no cultivables: llevamos más de 120 años preparando mal los medios de cultivo

Autoclavar juntos el fosfato y el agar inhibe el crecimiento de las bacterias

Robert Koch fue el primero que cultivó bacterias en medios sólidos. Primero empleó rebanadas de patata, pero se le contaminaban fácilmente con hongos ambientales. Luego empleó gelatina para solidificar los medios, pero algunos microorganismos son capaces de degradarla, se la comen. Además, la gelatina no se mantenía sólida a 37ºC, que es la temperatura a la que crecen la mayoría de los patógenos humanos. La idea de emplear agar la sugirió Angelina Fanny Eilshemius, la mujer de Walter Hesse, unos de los colaboradores de Koch. Angelina Fanny empleaba agar para solidificar las mermeladas y Walter se llevó el invento de la cocina al laboratorio y fue el primero que empleó agar en lugar de gelatina. La ventaja del agar es que permanece sólido a 37ºC, la mayoría de las bacterias no la degradan y además es trasparente, lo que facilita el examen de las colonias bacterianas. Llevamos más de 120 años usando el agar para preparar los medios y obtener cultivos puros bacterianos. Algo tan sencillo como los medios sólidos con agar en placas de Petri ha sido esencial para el desarrollo de la microbiología clínica y de estrategias para combatir las bacterias patógenas.


Sin embargo, desde el comienzo de la microbiología sabemos que existen muchos microorganismos que no crecen en los medios que les preparamos en el laboratorio y no los podemos cultivar. Las nuevas técnicas de secuenciación masiva han puesto de manifiesto la existencia de una enorme cantidad de microorganismos no cultivables, lo que se conoce como la materia oscura del universo microbiano (sobre este tema te puede interesar esta otra entrada de microBIO).

Ahora un grupo de investigadores japoneses han descubierto que la preparación de los medios de cultivo con agar, que llevamos haciendo desde los tiempos de Koch, puede inhibir el crecimiento de muchas bacterias. En realidad es un hecho conocido que el número total de células en un cultivo no suele coincidir con las que se cuentan sobre una placa de Petri, pero hasta ahora no sabíamos la razón. Estos autores han descubierto que cuando se autoclavan juntos el fosfato y el agar para preparar un medio sólido, la cantidad de colonias bacterianas totales que se obtiene es 50 veces menor que cuando se autoclavan de forma separada. Autoclavar juntos el agar y el fosfato genera compuestos tóxicos que inhiben el crecimiento bacteriano. El análisis químico sugiere que esta inhibición del crecimiento es debida a la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2), un agente oxidante tóxico.


Colonias de bacterias y hongos sobre una placa de Petri.

Además, secuenciaron un total de 6.528 colonias bacterias que crecían en los distintos medios. Comprobaron que en los medios con el fosfato autoclavado por separado había más de un 30% de géneros bacterianos clasificados como “no cultivables” que no crecían en los medios con fosfato y agar autoclavados juntos. Han comparado también los resultados de la secuenciación masiva de muestras ambientales con el cultivo. Como cabía esperar, observaron que la secuenciación revelaba muchos más grupos bacterianos que el cultivo: por ejemplo, mediante secuenciación directa fueron capaces de detectar 53 grupos bacterianos en muestras de suelo, pero solo 6 fueron capaces de crecer en los medios de cultivo. Esto confirma la idea de que la mayoría de los microorganismos ambientales son no cultivables.


Comparación de la proporción relativa de phyla aislados de distintas muestra ambientales (río, sedimento o suelo) crecidas en distintos medios de cultivo o mediante secuenciación directa del ADN total. En los medios PS o PW había más de un 30% de géneros bacterianos clasificados como “no cultivables” que no crecían en el medio PT. La secuenciación (454) revelaba muchos más grupos bacterianos que los cultivos. PT, medio con fosfato y agar autoclavados juntos. PS, medio con fosfato y agar autoclavados por separado. PW, medio sin fosfato. 454, pirosecuenciación directa (ver ref. 1).

Aunque ya se sabía que autoclavar juntos azúcares y fosfato o glucosa y proteínas puede generar componentes tóxicos que inhiben el crecimiento bacteriano, es la primera vez que se demuestra que autoclavar juntos el fosfato y el agar puede ser responsable de inhibir el crecimiento de muchas bacterias, que hasta ahora han sido clasificadas como “no cultivables”.

En tu próximo experimento haz la prueba, prepara el medio autoclavando por separado el agar y el fosfato, a ver qué pasa!

(1) A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Tanaka T, et al. Appl Environ Microbiol. 2014. 80(24):7659-7666.

8 comentarios:

  1. Me gusta mucho tu artículo Ignacio. Me gustaría republicarloo en nuestro escritorio de noticias (www.inngenious.es) por supuesto nombrando la fuente y agradecimientos. ¿Qué te parece?

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    1. Por supuesto!: lo que está en www. lo coges de la www. y lo devuelves a la www. Gracias!
      Ignacio

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  2. Es curioso que muchos medios mínimos/minerales usados para microbiología de bacterias asociadas a plantas... Indican que hay que preparar el medio y las sales por separado. Y añadirlas justo al sacarlo del autoclave. Son una minoría, y el argumento que siempre me dieron fue que "las sales precipitan" ... No me extrañaría que sea una "tradición" seguida sin ser consciente de la razón.

    Me pregunto si en el artículo dicen cuál es la temp a la que deja de ser negativo. Imagino que recién sacado del autoclave no cambiará mucho...y si esperas, lo mismo no queda homogéneo.

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  3. Impresionante. Qué buen trabajo! Con tu permiso reproduzco, obviamente citando la fuente.

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  4. Me voy a llevar el tema al huerto, al mío. Recuerdo un estudio de la Universidad de Navarra y el INIA sobre el exceso de abono y a. nitrogenado con sus nefastas consecuencias y problemas varios de enfermedades en las plantas. Recuerdo las bondades del P y el equilibrio ante lo anterior y la defensa ante muchas y diversas enfermedades de las plantas.
    La pregunta pues por lógica sería ¿qué diferencia existe entre el cultivo Tierra/P o Agar/P? salvando la cuestión lógica de que lo que se pretende es aislar un algo concreto, la viabilidad del cultivo microbiano debería ser la misma ¿o es un error de agricultor?
    Eduardo.

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    1. Gracias, Eduardo por tu comentario. No creo que se pueda relacionar agar/P con tierra/P, no tiene nada que ver. En este trabajo se estudia el efecto del autoclavado en el agar+P. No se puede extrapolar con el P en el suelo.
      Un saludo,
      Ignacio

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  5. Muy interesante. Justamente acabo de leer una noticia actual en la que parece que han encontrado la forma de ampliar el repertorio de bacterias que podemos cultivar:
    http://elpais.com/elpais/2015/01/07/ciencia/1420651243_369191.html

    Saludos.

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