domingo, 4 de septiembre de 2016

La variable invisible: los microbios del ratón son la razón de que tu experimento no se repita


Cambios en la microbiota del ratón de laboratorio pueden explicar por qué es tan difícil reproducir los resultados.

El ratón es uno de los animales de experimentación más empleado por los científicos. Para conocer la causa de una enfermedad, cómo se regula un gen in vivo, qué efecto tiene un tratamiento o una nueva vacuna antes de probarlo en humanos hay que hacerlo en ratoncitos de laboratorio. Algunos, exagerando un poco, dicen que hoy en día ya somos capaces de curar todas las enfermedades humanas … en el ratón.


Cuando se analizan las bacterias presentes en las heces de ratones de marcas distintas, la diversidad y abundancia de ciertos microbios es diferente (2).

Si alguna vez has trabajado con ratones ya sabrás que los experimentos in vivo suelen traer de cabeza a los investigadores: la variabilidad de los resultados es enorme y son difíciles de reproducir. Por eso, en estos experimentos in vivo te preocupas mucho de emplear ratoncitos que sean lo más parecidos posible entre ellos: del mismo vendedor, la misma cepa, peso, sexo, edad, de la misma camada. Además, intentas mantenerlos exactamente en las mismas condiciones: jaulas idénticas ordenadas en estanterías meticulosamente estandarizadas, con la misma comida y bebida, los mismos ciclos de luz/oscuridad, temperatura y humedad controlada. En ocasiones las jaulas tiene ventilación presurizada, como si cada ratón estuviera en la cabina de su propio avión privado. Esperas que cuanto más parecido sea todo, los resultados serán más homogéneos. Pero muy poca veces ocurre así. Siempre hay algún resultado con un ratón que se sale de la gráfica, el caso a parte, el maldito “outlier” que algunos malintencionados borran de la tabla.

¿Podemos asegurar un ambiente totalmente idéntico o puede haber variables escondidas que explican los resultados inconsistentes?

Cada vez hay más estudios que ponen de manifiesto la dificultad para replicar muchos de los resultados en experimentos preclínicos. La presión por publicar y el sesgo de evitar o suprimir resultados negativos explican en parte la falta de reproducibilidad. Pero también influyen pequeños cambios en el protocolo (algún pequeño detalle que se omite sin querer, o deliberadamente, en la sección de material y métodos), las distintas cepas de animales o diferentes ambientes en los laboratorios. 


Hay un factor que hasta ahora no le habíamos prestando mucha atención, una variable invisible: los microbios del interior del ratón. Cada vez somos más conscientes de que la microbiota del ratón puede arruinar tu experimento y ser la causa del problema de la reproducibilidad de los resultados.

La microbiota es el conjunto de microorganismos en el interior de un organismo.

Se ha publicado en Nature (1) un excelente artículo sobre el efecto de las interacciones entre el huésped y sus microbios en los resultados  experimentales. En realidad los mamíferos somos los que somos por una combinación entre nuestros genes con los de los microbios que nos habitan, lo que se define como metagenoma. Esto no solo incluye nuestras bacterias, sino también otros microorganismos como arqueas, hongos y levaduras, virus, protistas e incluso helmintos (pequeños gusanos parásitos). Cada vez somos más conscientes del efecto que estos pequeños huéspedes y sus genes tienen en nuestro interior y en el de cualquier mamífero. El metagenoma es en realidad una variable ambiental que influye en la fisiología del huésped.

El metagenoma es la suma de todos los genes del huésped más los de todos los microbios de su interior.

Nuestros microbios y sus genes tienen un efecto crítico en nuestra salud. Y lo mismo ocurre en otros mamíferos y, por supuesto, en los animales de experimentación. Hoy sabemos que la respuesta a un medicamento o tratamiento puede depender fácilmente de los microbios vivos que tengas en tu interior. Los microbios en el interior del ratón están siempre cambiando haciendo imposible la estandarización. Cuando se han tomado muestras de ratones control de experimentos distintos y se analiza la microbiota intestinal se comprueba que cada grupo tiene distinta composición. El zoo de microorganismos en el interior de cada animal puede variar por cualquier pequeña circunstancia, como la fuente de proteína en el pienso (aunque sea de la misma marca comercial). El estrés al separarlos, cada vez que retiramos un ratón de la jaula por ejemplo, puede cambiar el ecosistema microbiano, el delicado equilibrio en los microbios del ratón. La calidad del aire, el tipo y cantidad de comida, el pH del agua, … también pueden influir en la microbiota. Muchos investigadores no se preocupan de dónde viene la alimentación o el agua que le dan al ratón. 


Quizá te sorprenda, pero otros factores que pueden afectar a la respuesta del ratón son: la hora a la que los manipulas, infectas o das el tratamiento; el tipo de “cama” que tiene el ratón en la jaula; la altura a la que esté situada la jaula en la estantería; o el sexo de la persona que los manipula (2).

Cada vez hay más datos de cómo la microbiota residente puede influenciar en la susceptibilidad a una enfermedad, desde el VIH hasta el asma, o de cómo predispone a la obesidad, o influye en la forma en la que el cuerpo responde a la medicación. Pequeñas diferencias en la microbiota pueden explicar por qué los ratones con la misma mutación genética responden de forma diferente. 

Pero, ¿cuál es la microbiota normal del ratón de laboratorio? Es muy difícil saberlo. La microbiota puede cambiar según el sexo, edad y alimentación del ratón. Pequeños cambios ambientales pueden modificarla. Cuando se analizan las bacterias presentes en las heces de ratones de dos marcas distintas, la diversidad y abundancia de ciertos microbios es diferentes. Estos cambios pueden afectar a la respuesta inmune e inflamatoria. 

Y no vale quitar esos pequeños huéspedes del interior del ratón. Hoy sabemos que los microbios son críticos para la salud y el correcto funcionamiento del sistema inmune, hacen que el animal esté sano y robusto. ¿Cómo podemos entonces controlar esa variable?

Sabemos que la microbiota de ratones de la misma camada tiende a ser más parecida entre ello. Por eso, en todo experimento con ratones el grupo control debería ser siempre de la misma camada que el grupo experimental. Por ejemplo, es frecuente que cuando se estudia el efecto de una determinada mutación se compare el resultado de la cepa “salvaje” (el control sin la mutación) con el de cepas de ratones mutantes. Esos ratones suelen ser cepas que no provienen de la misma camada y que por tanto seguro que tienen una microbiota distinta. Concluir que la mutación es la causante del efecto es erróneo, porque no se está teniendo en cuenta la aportación de la microbiota y sus genes.

Una forma de mirar al mundo microbiano del ratón sería a través del ratón centinela. El ratón centinela es el que se deja solo en una jaula del mismo estante para controlar posibles patógenos que interfieran con el experimento. Se sacrifica la final de experimento y se buscan en él la presencia de microorganismo patógenos que hayan podido infectar las jaulas y afectar a los resultados. Cuando se detecta un patógeno, se esteriliza todos las jaulas del estante. Hasta ahora no se hace, pero también se podría incluir un ratón centinela para analizar la microbiota intestinal.

Algunos investigadores han mezclado sus ratones de laboratorios con ratones salvajes comprados en una tienda de mascotas. Estos ratones “sucios” suelen tener una microbiota intestinal mucho más rica y abundante y son una mejor aproximación a la microbiota humana, mejor que un ratón de laboratorio estándar. Además, los ratones “sucios” suelen ser portadores de enfermedades ya erradicadas en la mayoría de los ratones de laboratorio, como hepatitis o neumonía. La exposición a estas enfermedades llevada por sus compañeros de jaula, matan a casi un 25% de la colonia de ratones, pero los que sobreviven generan una respuesta inmune capaz de combatir la infección. Ahora estos ratones pueden ser un modelo mejor, más realista, para estudiar el sistema inmune y enfermedades infecciosas humanas, por ejemplo.

Nos hacen falta estrategias para monitorizar cómo los microbios pueden influir en la biología del ratón.

Conseguir que los resultados sea reproducibles es fundamental para el avance de la ciencia. Pero el tema es complejo. Los autores (1) proponen consensuar entre investigadores, agencias de financiación, revisores y editores de revistas científicas, e instituciones académicas una información mínima que debería añadirse a los experimentos con ratones. Entre esa información, además de detallar aspectos como la genética del ratón, el método experimental o el mantenimiento de los animales, se debería añadir el análisis de la microbiota y de su efecto sobre la biología del animal. No te tiene que extrañar, por tanto, que dentro de pocos años todos los estudios con ratones deban incluir un análisis de la microbiota fecal en la sección de material y métodos, ... si quieres que te lo publiquen.

Todos sabemos que lo que funciona en el ratón muchas veces no funciona en humanos. Pero, como vemos, incluso lo que funciona en un ratón, no funciona en otro. 

Para saber más:

(1) Accounting for reciprocal host–microbiome interactions in experimental science. 2016. Stappenbeck, T. S., y col. Nature 534, 191–199. doi:10.1038/nature18285

(2) Mouse microbes may make scientific studies harder to replicate. Servick, K. Science. August 16, 2016

(3) A mouse’s house may ruin experiments. Reardon, S. 2016. Nature 530, 264. doi:10.1038/nature.2016.19335 

2 comentarios: